1、形成方式不同 DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。
DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。
DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键。
DNA连接酶的作用是连接DNA链之间的磷酸二酯键,使其成为一个完整的DNA分子.例如在基因工程中可将运载体与目的基因相连接,形成重组DNA分子.DNA聚合酶的作用是在DNA复制时将单个的脱氧核苷酸连接成脱氧核苷酸长链.
它的用途是：①连接带匹配粘端的DNA分子，②使平端的双链DNA分子互相连接或合成的接头相连接。
大肠杆菌DNA连接酶能使互相匹配的5′突出端和3′突出端的双链DNA连接，反应中以NAD+作为辅助因子，基因工程不常用。
DNA连接酶：DNA连接酶可在两个寡核苷酸之间进行连接反应，同时必须与另一DNA链形成杂交体，相当于连接dsDNA中的缺口，反应在4565摄氏度条件下进行，需要NADsuperscript+superscript的参与。
一般用于检测等位基因的变化和PCR扩增中是。