3.在框的下方有许多可以设定的限制条件,如片段长度,一定包含的片段位置,引物长度,引物退火温度等,你可以进行设定 4.点击"pickup primers"就会出现下一页,上面会列出多种设计,一般来说,第一对引物是最适合的.同时引物设计。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区.同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构.如这个区域单链能形成二级结构,就要避开它.如这一段不能形成二级结构,那就可以在这一区域设计引物.现在可以在这一保守区域里设计一对引。
1、引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
2、引物长度一般在15-30碱基之间。
3、引物GC含量在40%-60%之间，Tm值最好接近72℃。
4、引物3′端要避开密码子的第3位。
5、引物3′端不能选择A，最好选择T。
6、碱基要随机分。
至少要在55-80℃之间，Tm值曲线以选取72度附近为佳，5'到 3’的下降形状也有利于引物与模板的结合；4、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。
PCR引物设计原则 1、引物长度一般在15-30bp。
引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不应大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应； 2、引物GC含量一般为40%-60%。